Метки в клетке
В 2014 году ученые Эрик Бетциг, Штефан Хелль и Уильям Мёрнер получили Нобелевскую премию по химии за создание флуоресцентного микроскопа. И хотя само изобретение не совсем из области химии, оно открыло дорогу множеству потенциальных открытий.
Дифракционный предел Аббе (0,2 мкм)
Что было до
До флуоресцентного микроскопа существовало два основных вида микроскопии: оптическая и электронная. Оптическая – классический вид микроскопии, не позволяющий преодолевать дифракционный предел, который ставил крест на многих химических и биохимических исследованиях. Говоря грубо, при приближении изображения в микроскопе картинка в какой-то момент теряла фокус – достигала дифракционного предела.
Частично преодолеть дифракцию удалось благодаря электронному микроскопу. В электронной микроскопии вместо светового потока используется пучок электронов, что позволило достигнуть увеличения в 108 раз. Однако у электронной микроскопии была одна большая проблема: пучок электронов убивал живые клетки.
Флуоресцентная микроскопия высокого разрешения позволяет изучать клетки и процессы внутри организмов в режиме реального времени.
Благодаря открытию изучать молекулярные и динамические процессы, протеины и ДНК стало наконец возможным. Технология работы флуоресцентного микроскопа основана на двух методах. Первый – подавление спонтанного испускания, позволяющий молекулам светиться, сдерживая другие окружающие излучения (разработка Штефана Хелля). Второй – возможность включать и выключать флуоресцентное излучение отдельных молекул (разработка Эрика Бетцига и Эрика Мёрнера).
Нобелевский комитет объяснил суть изобретения: «Сначала было доказано, что теоретический лимит микроскопа составляет половину длины волны видимого света, это несколько сотен нанометров. Давайте возьмем человеческий волос. Его толщина — несколько микрон, и его можно изучать традиционными микроскопами. Но в химии и биохимии объекты гораздо меньше. Стандартная бактерия — 100 нанометров, она попадает под вышеозвученный лимит, — объяснил представитель Нобелевского комитета. — Если изучить бактерии с помощью светового микроскопа, то их сложно разобрать. Лауреаты заложили основание спектроскопии. У электронных микроскопов возможности гораздо выше, можно рассмотреть структуры до атома. Но они не позволяют изучить живые клетки или процессы внутри живых клеток. Работы, которые провели лауреаты, дали возможность изучить молекулярные процессы в реальном времени. С помощью их работ можно изучить динамические процессы, читать ДНК, изучать протеины. Это открытие, в частности, помогло понять, как протеины соответствуют различным болезням, таким как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона».
Схема обмана «кота Шредингера»
Говоря простым языком, ученые нашли способ не светить на изучаемые объекты – вместо этого они заставили объекты светиться.
Константин Лукьянов, заведующий лабораторией Института биоорганической химии РАН, так объясняет смысл работы нового микроскопа: «Оптическая микроскопия обладает пределом разрешения, это дифракционный барьер, равный примерно половине длине световой волны, это где-то 200–250 нм. Флуоресцентная микроскопия преодолевает этот предел, достигая разрешения 20–25 нм, то есть в десять раз большего. Это позволяет видеть отдельные структуры, причем не только в фиксированных, а в живых клетках, можно увидеть их динамику, какие-то внутриклеточные процессы. Технологически это решается двумя разными способами, но если не вдаваться в детали, то получается очень красивая флуоресцентная картинка, которая приближается по разрешению к электронной микроскопии.
Вы вносите флуоресцентную метку в клетку, при этом вы специфически метите какую-то определенную структуру, или какой-то белок, или какое-то событие в клетке.
Краситель возбуждается светом и испускает свет другой длины волны. Например, вы светите синим, а флуоресценция у вас зеленая. В микроскопе есть источник возбуждающего света, система фильтров и детектор.
Многие процессы, которые раньше было невозможно увидеть, теперь стали видимыми. Например, очень активно этим методом изучается организация цитоскелета — клеточного скелета. Он состоит из микротрубочек и микрофиламентов, которые организованы в тоненькую сеть, и вы можете увидеть строение этой сети почти на молекулярном уровне. Стало возможным изучить детали прохождения нервного импульса, в частности в соавторстве со Штефаном Хеллем. Например, увидеть, как происходит передача нервного сигнала в синапсах — выброс синаптических пузурьков (везикул) с нейромедиаторами и эндоцитоз — захват их мембраной. Как все это происходит, было непонятно до появления флуоресцентной микроскопии».
Устройство флуоресцентной микроскопии
История открытия
Впервые один из Нобелевских лауреатов Штефан Хелль задумался об этом еще в 1994 году. Он подумал, что если нельзя осветить микрообъект, то нужно сделать так, чтобы он светился сам. В своих исследованиях ученый использовал два лазерных импульса: первый заставлял светиться молекулы, второй подавлял лишнее свечение. Этот метод он назвал STED-микроскопией на основе подавления спонтанного испускания.
Научное сообщество идею не одобрило. Однако Хелль решил реализовать её сам, переквалифицировался в экспериментатора и в 2000 году создал STED-микроскоп, который являлся, по сути, первым наноскопом. Хелль продемонстрировал его работу на бактерии и доказал, что дифракционного предела для микроскопии отныне не существует.
Примерно в это же время Эрик Бетциг и Уильям Мернер тоже заинтересовались флуоресценцией и разработали микроскопию одиночных молекул. О работах Хелля они не знали, однако Мернер научился включать и выключать излучение молекул, а Бетциг сделал так, чтобы с помощью этих переключений можно было найти, где молекулы располагаются. Сначала ученые переключали излучение молекул и фотографировали происходящее, а затем накладывали полученные изображения друг на друга.
В итоге в 2006 году в журнале Science была опубликована фотография мембраны лизосомы с беспрецедентным разрешением, сделанная при помощи флуоресцентной микроскопии.
Детальное изображение мембраны лизосомы, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии
Эрик Бетциг родился в США в 1960 году, защитил в 1980 докторскую степень, сейчас возглавляет исследовательскую группу в Медицинском институте Говарда Хьюза.
Штефан Хелль родился в Румынии в 1962 году, живет в Германии. Защитил докторскую в Университете Гейдельберга в 1990 году, сейчас является директором Института Макса Планка по биофизической химии и главой отдела в Немецком центре по изучению рака.
Уильям Мёрнер родился в 1953 году в США, защитил докторскую в 1982 году в Корнелльском университете, сейчас является профессором химии и прикладной химии в Стэнфордском университете.
Несмотря на то, что открытие не относилось к области химии, научное сообщество было в восторге и по достоинству оценило изобретение коллег. В комментариях, публикуемых на сайте Нобелевского комитета, звучали искренние благодарность и восхищение коллег: «Пьем за вас много-много шампанского!»
Благодаря этому открытию сегодня ученые используют микроскопию сверхвысокого разрешения, а технологии позволяют получать как латеральное, так и аксиальное разрешение, измеряемые в десятках нанометров и меньше. Это значит, что следующим шагом станет достижение разрешения порядка одного нанометра в оптических системах наноскопии.
Постскриптум
Через две недели после получения Нобелевской премии Эрик Бетциг совершил очередной прорыв – новый микроскоп, который во много раз превосходит по возможностям предыдущую модель, за которую троим исследователям вручили премию. С помощью нового микроскопа можно наблюдать отдельные клетки в 3D, не нанося им вообще никаких повреждений, и следить за движущимися объектами. По словам самого Бетцига, он начал думать над созданием последнего микроскопа с тех пор, как ему «осточертел старый». По его словам, он осознал, насколько старый микроскоп примитивен, и создал новый.
Главная проблема, с которой пришлось при этом столкнуться ученому – это сохранение пространственного разрешения и скорости на высоком уровне. Более того, он хотел, чтобы рассматриваемая клетка не получала никаких повреждений при процессе. В итоге Эрик Бетцига изменил конструкцию микроскопа и сделал так, чтобы свет подавался с боковой стороны устройства.
“В последние лет десять флуоресцентная микроскопия высокого разрешения переживает своего рода ренессанс. Созданы микроскопы с суперразрешением, с помощью которых можно рассматривать отдельные молекулы, двухфотонные лазерные микроскопы, позволяющие наблюдать живые ткани.
А нынешние разработки в области флуоресцентной микроскопии позволяют рассматривать отдельные белки и даже единичные нейроны в мозге.
Жду, когда мы сможем заглянуть внутрь наблюдаемых клеток и тканей. Вот тогда я успокоюсь!”
Эрик Бетциг
Валентина Пухтина
Владислав Чирин